乳酸菌诱导结肠癌细胞凋亡机制研究 mobi 下载 网盘 caj lrf pdf txt 阿里云

本专著以本实验室人员从中国西部地区传统发酵食品及婴儿、成人粪便中分离出的乳酸菌为供试菌株，以标准菌株Lactobacillus rhamnosus GG（A***C 43121，USA）为阳性对照菌株，筛选出具有益生功能（包括黏附于肠上皮细胞能力、耐受模拟胃液和模拟肠液能力），又具有显著抑制人结肠癌HT-29细胞增殖能力的4株乳酸菌（M5、X11、X12和K14）。再经过抗癌功能筛选，*终获得菌株X12、M5的细胞壁能显著诱导HT-29细胞DNA损伤和凋亡，并深入探讨其诱导结肠癌细胞凋亡的机理。

章结肠癌及乳酸菌功能关系概述

节引言

一、结肠癌简介

二、结肠癌发病症状

三、乳酸菌抑制结肠癌的可能途径

第二节人结肠癌的发病原因

一、结肠癌发病原因简述

二、环境化学物质诱发的结肠癌

三、饮食因素诱发的结肠癌

四、细菌酶诱发的结肠癌

第三节乳酸菌调控机体免疫功能

一、乳酸菌对非特异性免疫功能的影响

二、乳酸菌对特异性免疫功能的影响

三、乳酸菌激活机体的抗肿瘤免疫

第二章乳酸菌抗结肠癌功能研究进展

节乳酸菌抗结肠癌作用的机理

一、乳酸菌降低食源性致癌物质的毒性

二、乳酸菌抑制癌细胞生长及诱导癌细胞凋亡

三、乳酸菌对潜在致癌物质致癌作用的阻断

四、乳酸菌对饮食诱发结肠癌作用的阻断

第二节乳酸菌不同菌体成分抗结肠癌作用机理

一、乳酸菌的菌体细胞抗结肠癌作用研究

二、乳酸菌的菌体细胞壁抗结肠癌作用研究

三、乳酸菌的菌体细胞质抗结肠癌作用研究

四、乳酸菌的菌体代谢产物抗结肠癌作用研究

第三节乳酸菌与线粒体凋亡***途径

一、活性氧族

二、线粒体凋亡途径

第四节国内开展的课题相关研究

第三章乳酸菌抗肿瘤研究技术方法

节乳酸菌抗肿瘤研究设施、材料

一、实验仪器与设备

二、实验所用试剂与药品

三、实验所用菌株与细胞

四、实验用培养液

第二节乳酸菌抗肿瘤研究检测方法

一、对结肠癌细胞增殖抑制能力的测定

二、乳酸菌对人肠道上皮细胞黏附性能的测定

三、乳酸菌对酸耐受能力的测定

四、乳酸菌对胆盐耐受能力的测定

五、乳酸菌16S rDNA 的鉴定

六、蛋白浓度的测定

七、乳酸菌肽聚糖分子量的检测

八、乳酸菌肽聚糖氨基酸组成分析

九、乳酸菌菌体和肽聚糖的形态学观察

十、HT-29细胞毒性的测定

十一、HT-29细胞形态学观察

十二、HT-29细胞DNA损伤的测定

十三、HT-29细胞凋亡与坏死的测定

十四、HT-29细胞周期的测定

十五、HT-29细胞线粒体膜电位的测定

十六、HT-29细胞ROS的检测

十七、HT-29细胞线粒体和胞浆中细胞色素C的检测

十八、HT-29细胞总RNA的提取

十九、体外反转录合成及RT-PCR反应

二十、HT-29细胞总蛋白提取与蛋白含量的测定

二十一、HT-29细胞总蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

二十二、Western blot分析

第四章乳酸菌抗肿瘤核心技术研究

一、抗结肠癌功能乳酸菌菌株的体外筛选

二、抗结肠癌功能乳酸菌菌体成分的筛选

三、乳酸菌肽聚糖对HT-29细胞的抑制作用

四、乳酸菌肽聚糖诱导HT-29细胞凋亡途径的研究

五、乳酸菌肽聚糖诱导HT-29细胞凋亡线粒体途径研究

六、数据处理及统计分析

第五章抗结肠癌功能乳酸菌的筛选

节引言

第二节基于抑制HT-29细胞增殖能力筛选抗结肠癌乳酸菌

第三节基于乳酸菌的益生功能筛选抗结肠癌功能乳酸菌

一、乳酸菌黏附于肠上皮细胞的能力

二、乳酸菌对模拟胃液的耐受能力

三、乳酸菌对模拟小肠液的耐受能力

第四节乳酸菌菌种鉴定

第五节本章小结

第六章抗结肠癌功能乳酸菌菌体成分的筛选

节引言

第二节乳酸菌细胞壁和细胞质的提取及蛋白含量测定

一、考马斯亮蓝G-250标准曲线

二、乳酸菌细胞壁和细胞质蛋白质浓度计算

第三节基于抑制HT-29细胞增殖能力筛选乳酸菌菌体成分一、乳酸菌细胞壁和细胞质对HT-29细胞增殖的抑制

二、乳酸菌细胞壁和细胞质对HT-29细胞的毒性作用

第四节基于诱导HT-29细胞DNA损伤筛选乳酸菌菌体成分

一、单细胞凝胶电泳实验

二、琼脂糖凝胶电泳实验

第五节基于诱导HT-29细胞凋亡筛选乳酸菌菌体成分

一、乳酸菌细胞壁和细胞质诱导HT-29细胞的凋亡

二、乳酸菌细胞壁和细胞质对HT-29细胞膜电位的影响

三、乳酸菌细胞壁和细胞质对HT-29细胞周期的影响

四、乳酸菌细胞壁和细胞质对HT-29细胞形态学的影响

第六节乳酸菌细胞壁对正常细胞毒性影响

第七节本章小结

第七章乳酸菌肽聚糖对HT-29细胞抑制作用

节引言

第二节乳酸菌肽聚糖对HT-29细胞增殖的抑制

一、5-氟尿嘧啶对HT-29的毒性作用

二、MTT实验

三、台盼蓝染色实验

第三节乳酸菌肽聚糖理化性质分析

一、乳酸菌肽聚糖蛋白含量的测定

二、乳酸菌肽聚糖分子量的测定

三、乳酸菌肽聚糖氨基酸组成及含量

四、扫描电镜观察乳酸菌肽聚糖形态

五、透射电镜观察乳酸菌肽聚糖形态

第四节乳酸菌肽聚糖诱导HT-29细胞凋亡

一、HE染色

二、Hoechst荧光染色

三、透射电镜观察乳酸菌肽聚糖诱导HT-29细胞线粒体的损伤

四、乳酸菌肽聚糖对HT-29细胞周期的影响

五、乳酸菌肽聚糖诱导HT-29细胞凋亡

第五节乳酸菌肽聚糖对正常细胞毒性影响

第六节本章小结

第八章肽聚糖诱导HT-29细胞凋亡途径研究

节引言

第二节乳酸菌肽聚糖对HT-29细胞凋亡相关基因的影响

一、HT-29细胞总RNA的提取

二、乳酸菌肽聚糖对HT-29细胞凋亡相关基因的影响

三、乳酸菌肽聚糖对HT-29细胞Cyto-C基因表达的影响

第三节乳酸菌肽聚糖诱导HT-29细胞凋亡机制研究

一、乳酸菌肽聚糖诱导HT-29细胞线粒体膜电位的损失

二、乳酸菌肽聚糖诱导HT-29细胞ROS的堆积

三、乳酸菌肽聚糖诱导HT-29细胞线粒体Cyto-C的释放

四、乳酸菌肽聚糖诱导HT-29细胞凋亡相关蛋白的变化

第四节本章小结

总结

展望

参考文献

王淑梅，女，1979年4月生人，******员。2005年7月到哈尔滨学院参加工作，现为哈尔滨学院食品工程学院教师，职称讲师，现主讲《食品营养学》、《乳品工艺学》、《食品安全预警》等食品专业课程。2001年、2005年分别获得东北农业大学学士学位和硕士学位，2014年获得哈尔滨工业大学工学博士学位，2015年6月至今在东北农业大学食品学院博士后流动站做博士后研究，2018年9月至今在美国伊利诺伊大学-香槟分校做学术交流访问。作者长期从事乳酸菌及其活性代谢产物研究及功能性益生菌的研发，是哈尔滨市级科研团队“应用微生物”团队成员。

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章结肠癌及乳酸菌功能关系概述节引言一、结肠癌简介结肠癌（Colon cancer）是威胁人类健康和生命的一类恶性疾病（图1-1），其发病率和死亡率均很高。结肠癌在男性癌症发病率中仅次于肺癌和前列腺癌，位居第三位，而在女性癌症发病率仅次于肺癌和***癌。图1-1结肠结构图与结肠癌

Fig 1-1The structure of colon and colon cancer

在中国结肠癌每年的新增病例高达40万，而全球每年的新增病例约1 000多万。结肠癌主要为腺癌、黏液腺癌、未分化癌。人结肠癌多数发生在大肠底部，在直肠内及其附近的地方，直肠与乙状结肠交界。

结肠癌可沿肠壁环行发展，沿肠管纵径上下蔓延或向肠壁深层浸润，除经淋巴管、血流转移和局部侵犯外，还可向腹腔内种植或沿缝线、切口面扩散转移。大体形态呈息肉状或溃疡型等。慢性结肠炎患者、结肠息肉患者、男性肥胖者等是易感人群。结肠的慢性炎症使肠癌的发生率比一般人群高。有结肠息肉者，结肠癌发生率是无结肠息肉者的5倍。家族性多发性肠息肉瘤，癌变的发生率更高。

二、结肠癌发病症状

结肠癌早期可能没有任何症状，中晚期可表现为腹胀、消化不良，而后出现排便习惯改变，腹痛，黏液便或黏血便。肿瘤溃烂、失血或毒素吸收后，常出现贫血、低热、乏力、消瘦或者下肢水肿等症状。如出现腹胀、腹痛、便秘或不能排便，体检见腹部膨隆、局部有压痛，听诊闻及肠鸣音，提示可能出现不全性或完全性肠梗阻。若肿瘤与网膜、周围组织浸润粘连，就形成不规则包块。晚期可出现黄疸、腹腔积液、水肿，肝、肺转移等症状，恶病质，锁骨上淋巴结肿大等肿瘤远处扩散转移的表现。

三、乳酸菌抑制结肠癌的可能途径

人体结肠微生态系统复杂，是重要代谢器官。肠道内每克内容物中活菌体的数量远大于1011个，甚至可达1014个，占人体总微生物量的78%。一般来说，肠道菌群可起到保护结肠的作用，但是当菌群数量减少50%以上时，就丧失了保护结肠免受致癌物损伤的能力。因此，若人体经常摄入一定量乳酸菌制剂势必对肠道起到保护作用，也抑制了结肠癌的发生。

在20世纪初，就有研究发现保加利亚人长寿与其长期食用发酵乳制品有关。之后，大量研究资料显示人体摄入发酵乳制品对健康有益。乳酸菌就是一群生活在机体内并且有益于宿主健康的一类活的微生物，通常是指具有高选择性的乳酸菌（Lactic acid bacteria LAB），定植于人体肠道并起到一定的益生作用。其中乳酸杆菌和双歧杆菌是乳酸菌的重要成员，两者不仅是人体生理性细菌，对宿主无致病性，还可维持宿主肠道健康，预防或抑制宿主癌症的发生。

1978年首次报道了婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis,B.infantis）在小鼠体内的抗肿瘤功能，此后，大量的体内实验证实了富含乳酸菌的发酵食品对人体有益，且能抑制肿瘤的发生。如长期食用酸奶酪或发酵乳制品可降低结直肠癌或其他癌症的发生率，而摄入保加利亚酸乳则可抑制结肠肿瘤的生长，摄入乳酸菌也会使尿液中对结肠细胞有害的遗传毒性成分减少等。

一般来说，乳酸菌是通过几个途径来实现抑制结肠癌功能的。

① 改变人体胃、肠道菌群的代谢活性。

② 改变宿主结肠的理化特性。

③ 在结肠内结合或降解潜在的致癌物质。

④ 可以与其他微生物或病原体直接发生作用，改变宿主肠道微生物菌群的种类或数量。

⑤ 乳酸菌菌体或其代谢产生抗肿瘤或抗诱变的物质。

如乳酸菌活菌体细胞、热致死菌体细胞、细胞壁、细胞质、菌体DNA或其代谢产物等都能起到抑癌作用。

⑥ 起到免疫屏障保护作用，调节机体免疫系统。

作者所在实验室前期研究成果也显示，分离自中国西部少数民族地区传统发酵乳制品和婴儿粪便的乳酸菌活菌体、细胞壁和菌体DNA在体外可促进免疫因子的释放，具有调节机体免疫的功能。

⑦ 对宿主生理代谢产生影响等。

乳酸菌的这些功能体现在保护机体免受感染，预防癌症的发生，维持肠道内环境的稳定等方面。因此，乳酸菌制品已逐渐得到人们的广泛应用，并在提高人体免疫机能、抑制肿瘤发生和生长等方面受到人们的高度关注。对此，人们进行了大量体外研究和动物体内的研究，但是对于乳酸菌作用机理尚不十分清楚。

临床上用于治疗人结肠癌的药物很多，但均有不同程度的副作用，研发新型、无毒副作用的结肠癌靶向治疗药物一直是研究重点。研究资料已证实乳酸菌是人体有益菌，在体内可降低结肠癌的发病率，但是截至目前有关乳酸菌的研究仅停留在可提高机体免疫力，改变肠道微生物菌群的数量、种类或代谢活性等方面的研究。且我国乳酸菌研究起步较晚，基础很薄弱，虽然市场上涌现出许多乳酸菌相关产品，但所使用的菌株多数购自国外，我国尚无自主产权的抗结肠癌功能性乳酸菌菌株。因此，通过有效筛选获得具有抗结肠癌功能的优良菌种，开发具有抗肿瘤功能的高效乳酸菌及其制剂将成为今后研究的重点，临床上配合治疗结肠癌的药物使用，必将为结肠癌治疗带来新的契机。

第二节人结肠癌的发病原因

导致人结肠癌发病的原因很多，如遗传、环境和饮食等因素，但其中重要的是环境因素，而环境因素中主要的当属饮食因素，这些因素通常是协同作用而引发结肠癌。近年来，随着人们生活水平逐步提高，相应的膳食结构也随之发生改变，高脂肪、高蛋白和低纤维的饮食构成导致了人结肠癌的发病率呈上升趋势。与此相反，若人体多摄入蔬菜、水果和谷物类等食物则可降低结肠癌的发病率。

一、结肠癌发病原因简述

Theo等人于2000年将诱发结肠癌的环境因素划分为自然环境因素（人居住的地理位置、辐射、饮水和空气污染等）和非自然环境因素（饮食习惯、吸烟、饮酒和吸食毒品等），而环境因素中主要的当属饮食因素，多种因素协同作用导致人体肠道菌群的失衡，诱发了结肠癌。

结肠癌的发生是多种原癌基因和抑癌基因相互协同作用的结果。结肠组织发生癌变的分子机理很复杂，但主要有如下几类。

① 结肠上皮细胞DNA发生损伤，但与修复相关的基因丧失修复功能，导致了基因错配修复等；

② 结肠癌变的基因被激活或者过度表达；

③ 抑癌基因发生突变或丢失；

④ 微卫星的不稳定；

⑤ 端粒酶的过度表达，细胞无限地进行繁殖；

⑥ 细胞***转导调控紊乱，细胞凋亡机制障碍；

⑦ DNA复制过程中体细胞的微卫星不稳定，发生了碱基错配导致重要的基因功能发生改变。

除此之外，诱发结肠癌的还有肠道微生物菌群所产生的细菌酶，这些细菌酶在肠道释放致癌物或将无毒的非致癌物质转化成有毒的致癌物质，从而间接地诱发了结肠癌。

二、环境化学物质诱发的结肠癌

环境污染与人类疾病的发生密切相关，人体一次大剂量或多次少剂量接触或摄入有毒有害的环境化学物均可诱发癌症。通常可诱发结肠癌的环境化学物有1,2-二甲基肼（1,2-Dimethyl hydrazine，DMH）、亚硝基胍（N-methyl-N-nitro-N-nitroso-guanidine，MNNG）、杂环胺（Heterocyclic amines，HCA）和多环芳烃（Polycyclic Aromatic Hydrocarb***，PAH）等。有害环境化合物可在人体消化道内破坏肠道黏膜系统，从而引发肠道癌症。体外实验表明N-亚硝基吗啉(N-Nitrosomorpholine，NMOR)减少了大鼠V79 细胞和人肠道黏膜细胞（实验选用人结肠癌Caco-2细胞模拟人肠道黏膜细胞）的活性。体内实验表明DMH对实验动物有很强的致癌作用，故DMH也常用做体内实验研究时结肠肿瘤的诱变剂。

三、饮食因素诱发的结肠癌

Jenkins等人早在1986年就已指出高蛋白、高脂肪和低纤维的不均衡饮食结构可诱发人的结肠癌。流行病学研究显示，尤其在美国和英国，加工过的肉类摄入量与人结肠癌发病率有直接关系。西方发达国家结肠癌发病率明显高于亚洲等其他发展中国家，主要原因就是上述不均衡的饮食结构造成的。

2007年，世界癌症研究基金会（WCRF）和美国癌症研究协会（AICR）均强调加工肉产品的摄入提高了人结肠癌的发病率。因此，加工肉类摄入量与人结肠癌发病率之间存在直接的关系。加工肉产品中含有亚硝酰血红蛋白，有助于N-亚硝基化合物的生成，N-亚硝基化合物在消化道内进一步诱发肠道黏膜细胞DNA损伤或生成N-亚硝基化合物-DNA复合物。加工肉类的制作过程除了产生N-亚硝基化合物外，也使产品中杂环胺、多环芳烃和血红素铁等物质含量增高，这些物质均是结肠癌的诱变剂。因此，过多地摄入加工肉类食物，不仅提高粪便N-亚硝基化合物含量，其肠道癌症的发病率也随之升高。

由此看出，人的饮食习惯确是诱发结肠癌的关键因素。高脂肪含量的食物不仅***胆汁分泌增加，还可促进肠道内某些厌氧细菌的生长。胆醇和胆盐经过厌氧菌的分解，次级胆酸（如脱氧胆酸和石胆酸）在肠道内含量就有所增加，而脱氧胆酸和石胆酸都是致癌物质，便可诱导人结肠癌的发生。另外，人们在腌制食品过程中所产生的亚硝酸盐类化合物或烹饪、烧烤食品过程中所产成的杂环胺类等物质也均有诱发结肠癌的作用。

（一）次级胆酸

胆汁酸是胆固醇在肝脏分解代谢的产物，它是一类胆烷酸的总称。从来源上胆汁酸可分为初级胆汁酸和次级胆汁酸。在肝细胞内以胆固醇为原料直接合成的胆汁酸是初级胆汁酸，而初级胆汁酸在大肠内受细菌的分解和脱羟作用就生成了次级胆汁酸、脱氧胆酸和石胆酸。次级胆汁酸是肠道类肿瘤的诱导剂，具有生物学毒性作用，可诱变细胞，溶解细胞，并诱导细胞DNA断裂等作用。

体内研究显示在腺瘤性息肉和结肠癌病人血清和结肠中次级胆酸的含量明显增高。体外实验也证实结肠中脱氧胆酸和鹅脱氧胆酸可促进人结肠腺瘤AA/C1细胞的增殖和减弱AA/C1细胞凋亡的作用。若人体长期饮食高脂肪、高蛋白和低纤维食物，就会在结肠内产生大量次级胆酸和胆汁酸粪便酶，就可直接引发结肠癌。

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前言

前言结肠癌是威胁人类健康和生命的恶性疾病，是世界上第三大癌症，其发病率和死亡率均很高。结肠癌多数发生在大肠底部，在直肠内或者附近的地方。结肠癌的致癌因素有很多，如遗传因素、环境因素和饮食因素等，这些因素通常是协同作用而引发癌症，但是其中重要的诱发因素是饮食因素。高脂肪、高蛋白和低纤维的饮食导致人结肠癌的发病率上升，而摄入乳酸菌对结肠癌有预防和抑制作用。研究显示，人体摄入乳酸菌对结肠癌有一定的抑制作用。乳酸杆菌和双歧杆菌作为乳酸菌的重要成员广泛存在于人体内。两者不仅是人体生理性细菌，维持宿主肠道的健康，还一定程度上抑制癌症的发生。

本专著以本实验室人员从中国西部地区传统发酵食品及婴儿、成人粪便中分离出的乳酸菌为供试菌株，以标准菌株鼠李糖乳酸杆菌（Lactobacillus rhamnosus）GG（A***C 43121，USA）为阳性对照菌株，筛选出具有显著抑制人结肠癌HT-29细胞增殖能力的乳酸菌，并深入探讨其诱导结肠癌细胞凋亡的机理。

著者2019年1月